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Eficacia comparativa de cuatro protocolos para la extracción de
ADN en
Cordia alliodora
: Evaluación de pureza, rendimiento y
costo
.
Comparative efficacy of four protocols for DNA extraction in
Cordia
alliodora
: Evaluation of purity, yield and cost.
Eficácia comparativa de quatro protocolos para extração de ADN em
Cordia alliodora
: avaliação da pureza, rendimento e custo.
Carranza
-
Patiño
,
Mercedes
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
mcarranza@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0000
-
0002
-
0917
-
0415
Rivera
-
Gamarra
,
Anais
Elizabeth
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
ariverag@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009
-
0002
-
1224
-
4638
Herrera
-
Feijoo
,
Robinson J.
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
rherreraf2@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0000
-
0003
-
3205
-
2350
Coello
-
Cevallos
,
Wilso
n José
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
wcoelloc@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009
-
0002
-
3064
-
239X
Mendoza
-
León
,
Antonio
Francisco
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
amendoza@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0000
-
0001
-
5103
-
0152
DOI /
URL:
https://doi.org/10.55813/gaea/ccri/v5/n2/600
Como citar:
Carranza
-
Patiño, M., Rivera
-
Gamarra, A. E., Herrera
-
Feijoo, R. J., Coello
-
Cevallos, W. J., &
Mendoza
-
León, A. F. (2024). Eficacia comparativa de cuatro protocolos para la extracción de
ADN en Cordia alliodora: Evaluación de pureza, rendimiento y costo.
Código Científico
Revista De Investigación
, 5(2), 1587
–
1601.
https://doi.org/10.55813/gaea/ccri/v5/n2/600
.
Recibido:
2
8
/
1
0/
202
4
Aceptado:
2
1
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Publicado:
3
1
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Resumen
La obtención de ADN de alta calidad es crucial para el estudio genético y la conservación de
Cordia alliodora
. Este estudio evaluó la eficacia de cuatro protocolos de extracción de ADN:
Doyle y Doyle (1990), CTAB, Dellaporta et al. (1983), y PureLink® Plant Total DNA
Purification Kit, utilizando un diseño completamente aleatorizado con hojas en estado
intermedio
de madurez. La cantidad y calidad del ADN se cuantificaron mediante técnicas de
imagenología. El protocolo CTAB obtuvo el mejor rendimiento, con 46,25 ng/µl de ADN y
alta pureza, siendo eficaz en la eliminación de polifenoles y taninos. A pesar de ser meno
s
costoso, el método de Dellaporta et al. (1983) mostró menores niveles de pureza y rendimiento.
Por lo tanto, el protocolo CTAB se recomienda como la mejor opción para la extracción de
ADN de alta calidad en C. alliodora.
Palabras clave:
conservación, inhibidores, protocolo, cuantificación, rendimiento.
Abstract
Obtaining high quality DNA is crucial for the genetic study and conservation of
Cordia
alliodora
. This study evaluated the efficacy of four DNA extraction protocols: Doyle and
Doyle (1990), CTAB, Dellaporta et al. (1983), and PureLink® Plant Total DNA Purification
Kit, using a completely randomized design with leaves at intermediate maturity. DNA qua
ntity
and quality were quantified by imaging techniques. The CTAB protocol obtained the best yield,
with 46.25 ng/µl of DNA and high purity, being effective in
removing polyphenols and tannins.
Despite being less expensive, the method of Dellaporta et al. (1983) showed lower levels of
purity and yield. Therefore, the CTAB protocol is recommended as the best option for high
quality DNA extraction in C. alliodora.
Keywords:
conservation, inhibitors, protocol, quantification, yield.
Resumo
A obtenção de DNA de alta qualidade é crucial para o estudo genético e a conservação de
Cordia alliodora
. Este estudo avaliou a eficácia de quatro protocolos de extração de ADN:
Doyle e Doyle (1990), CTAB, Dellaporta et al. (1983) e PureLink® Plant Total DNA
Purification Kit, utilizando um delineamento inteiramente casualizado com folhas de
maturidade interm
édia. A quantidade e a qualidade do ADN foram quantificadas por técnicas
de imagem. O protocolo CTAB obteve o melhor rendimento, com 46,25 ng/µl de ADN
e
elevada pureza, e foi eficaz na remoção de polifenóis e taninos. Apesar de ser menos
dispendioso, o método de Dellaporta et al. (1983) apresentou níveis de pureza e rendimento
inferiores. Assim, o protocolo CTAB é recomendado como a melhor opção para a e
xtração de
ADN de alta qualidade em
C. alliodora
.
Palavras
-
chave:
conservação, inibidores, protocolo, quantificação, rendimento.
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Introducción
Cordia alliodora
es una especie arbórea de rápido crecimiento y alta calidad maderable,
nativa de los trópicos de América. Su relevancia ecológica y económica radica en su uso en
programas de reforestación y agroforestería, así como en su capacidad para actuar como
sumide
ro de carbono y refugio para fauna local
(Cañadas
-
López et
al., 2023)
.
Estos factores la
convierten en una especie clave para la mitigación del cambio climático y la conservación de
la biodiversidad en áreas tropicales
(Andrade et
al., 2023)
.
La extracción de ADN de alta calidad en
C. alliodora
enfrenta complicaciones debido
a la presencia de metabolitos secundarios como polifenoles y taninos, que afectan la pureza y
el rendimiento del ADN obtenido
(Marulanda et
al., 2011)
.
Estos compuestos interfieren con
los procesos de extracción al unirse al ADN o a las enzimas involucradas
. El resultado de este
proceso es
una menor calidad del material genético disponible para estudios genéticos
avanzados, como la diversidad genética y la conservación
(Delgado
-
Paredes et
al., 2021)
.
Es
crucial optimizar las técnicas de extracción para mejorar la calidad y cantidad del ADN,
especialmente en investigaciones que buscan la caracterización genética de esta especie
(Evallo
et
al., 2022)
.
La capacidad de realizar extracciones de ADN precisas y eficaces es un componente
crucial para la investigación genética moderna
(Lara et
al., 2021)
.
En especies vegetales con
alto
s
niveles
de inhibidores químicos,
como
C. alliodora
, la optimización
d
el método de
extracción
garantiza la integridad del ADN obtenido
. La
mejora del método de extracción
permite que los análisis genéticos subsecuentes, como la secuenciación o los estudios de
variabilidad genética, sean más confiables y precisos
(Gautam, 2022; Nath et
al., 2022)
.
La
obtención de ADN de alta calidad no solo mejora la precisión de los resultados genéticos, sino
que
también facilita la identificación de marcadores importantes para la conservación y
mejoramiento de la especie
(Yuan et
al., 2019)
.
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Diversos métodos han sido propuestos para superar estos problemas, siendo los
protocolos basados en CTAB eficaces en la eliminación de inhibidores en plantas que contienen
compuestos secundarios en altos niveles
(Wanere et
al., 2023)
. E
l objetivo de este
estudio
es
evaluar la eficacia de cuatro protocolos de extracción de ADN en
Cordia alliodora
,
comparando su rendimiento en términos de pureza, cantidad de ADN obtenido y costos
asociados, para identificar el método más eficiente y adecuado para esta especie.
Metodología
Localización de la investigación
El estudio se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Técnica
Estatal de Quevedo, ubicada en el km 75 de la vía Quevedo
–
El Empalme, en la provincia de
Los Ríos, Ecuador. Las coordenadas geográficas de la zona son 1°04’49” de latitud
sur y
79°32’42’’ de longitud oeste, a una altitud de 66
m
s
.
n
.
m.
Tratamientos
S
e evaluaron cuatro protocolos de extracción de ADN en
Cordia alliodora
como
tratamientos experimentales: Doyle y Doyle (1990),
CTAB modificado por
Betancurt
-
Olvera
et
al.
(2018)
, Dellaporta et al. (1983) y PureLink® Plant Total DNA Purification Kit
(Invitrogen).
Estos tratamientos se aplicaron a hojas jóvenes y adultas de la especie, siguiendo
un Diseño Completamente al Azar (DCA) con cuatro repeticiones por tratamiento, permitiendo
una comparación rigurosa en términos de pureza, rendimiento y costos.
Manejo del experimento
Se utilizaron procedimientos estandarizados para la recolección del material vegetal y
la extracción de ADN. Las hojas
en estado intermedio de madurez
de
Cordia alliodora
se
recolectaron
bajo
condiciones controladas, siendo identificadas y transportadas en bolsas de
papel dentro de una hielera para preservar su integridad. Posteriormente, se lavaron con agua
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destilada para eliminar cualquier residuo superficial y se almacenaron a
-
40°C hasta su
procesamiento
lo que minimizó la degradación enzimática o contaminación microbiana
.
La
extracción de ADN se llevó a cabo bajo condiciones controladas en el laboratorio,
siguiendo protocolos establecidos para asegurar la pureza y el rendimiento del ADN. Se
evaluaron los costos asociados a cada método, incluyendo los reactivos y materiales ut
ilizados,
junto con un análisis del rendimiento en términos de cantidad y calidad del ADN obtenido.
Finalmente, se realizó una comparación costo
-
eficiencia para identificar el método que
proporcionara el mejor equilibrio entre costos y efectividad en la ob
tención de ADN de alta
calidad.
Variables evaluadas
Cantidad de ADN
La cantidad de ADN extraído se cuantificó mediante
técnica de imagenología donde las
imágenes de geles de agarosa
se utilizaron con
el software GelAnalyzer
. Las bandas de ADN
obtenidas
fueron comparadas con un marcador molecular
de 100 pb, lo que permitió
estimar
con precisión
la concentración de ADN en cada muestra
(Wittmeier y Hummel, 2022)
.
Calidad del ADN
La calidad del ADN se evaluó mediante una escala cualitativa en gel de agarosa al 1%,
clasificando las muestras en tres categorías: malo, regular y bueno,
basándose en la intensidad
y definición de las bandas observadas
(Bawane et
al., 2024)
.
Costos por tratamiento
Se analizaron los costos totales de cada protocolo de extracción, considerando los
gastos en reactivos, materiales y eficiencia en la extracción de ADN, con el
fin
de determinar
el equilibrio
entre
costo
-
eficiencia de cada tratamiento
(Jangra y Ghosh, 2022; Marcos
-
Merino
et
al., 2020)
.
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Análisis estadístico
Se aplicó un Análisis de Varianza (A
DEVA
) para evaluar si existían diferencias
significativas entre los tratamientos empleados en la extracción de ADN. Este análisis permitió
comparar los protocolos en términos de rendimiento y pureza del ADN obtenido.
Para
comparaciones posteriores entre tratamientos,
se utilizó la prueba de Tukey con un nivel de
confianza del 95% (p < 0.05)
,
procesado mediante el software InfoStat
(Universidad Nacional
de Córdoba, 2017)
.
El análisis estadístico se complementó con la evaluación de costos,
integrando estos datos en un análisis de costo
-
eficiencia para
identificar
el tratamiento
que
más
equilibr
ó la relación
entre rendimiento y costo.
Resultados
1.1.
Cantidad de ADN
El protocolo
CTAB modificado por
Betancurt
-
Olvera et
al. (2018)
mostró el mayor
rendimiento de ADN en
C
. alliodora
, con una media de 46,25 ng/µl
, aunque fue
estadísticamente igual al de Dellaporta et al (1983) y al de Doyle y Doyle (1990).
En contraste,
el protocolo PureLink® obtuvo el menor rendimiento, lo cual fue significativamente inferior
al de los demás métodos
Figura 1.
Estos resultados destacan al protocolo CTAB como la opción
más eficiente en términos de cantidad de ADN extraído, mientras que PureLink® se caracteriza
por su bajo rendimiento en este parámetro
.
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Figura 1
Promedio de la cantidad de ADN obtenida a partir de los diferentes protocolos en C. alliodora.
Nota:
Las medias con letras iguales no muestran diferencias estadísticas significativas entre ellas, de acuerdo con
la
prueba de Tukey (p < 0,05).
Autores (2024).
1.2
.
Calidad de ADN
La calidad del ADN se evaluó utilizando una escala cualitativa basada en la observación
de las bandas obtenidas en gel de agarosa. Aunque no se realizaron mediciones
espectrofotométricas, la correlación entre los resultados observados y la escala de pureza
utilizada permitió garantizar la integridad del ADN extraído. El protocolo CTAB modificado
por
Betancurt
-
Olvera et
al. (2018)
demostró la mayor calidad, con un promedio de 2,83 en la
escala cualitativa, posicionándose como el método más efectivo en este aspecto (letra "a").
La figura
2
se
compara los valores promedio de calidad del ADN obtenidos mediante
cuatro protocolos de extracción
.
Estos resultados respaldan la superioridad del protocolo
CTAB en la obtención de ADN de alta calidad, destacándolo como la mejor opción para
aplicaciones que requieren material genético puro y consistente. Aunque los demás protocolos
presentan niveles acep
tables de calidad, sus ligeras limitaciones podrían restringir su
aplicabilidad en estudios que demanden ADN de máxima pureza.
El
protocolo C
TAB presentó
la mayor calidad de ADN, lo que lo posiciona como el más efectivo en este parámetro
.
Dellaporta et al. (1983) también mostró una alta calidad promedio con resultados
estadísticamente similares a CTAB
.
El protocolo Doyle and Doyle (1990) tuvo un promedio
ligeramente inferior considerado estadísticamente intermedio
,
mientras que el PureLink® Plant
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1594
Total DNA Purification Kit presentó la menor calidad
.
Estos resultados confirman la
superioridad del protocolo CTAB en términos de calidad del ADN, mientras que los otros
métodos, aunque eficaces, presentan variaciones que podrían limitar su aplicabilidad en
contextos que requieren ADN de máxima pureza.
Figura 2
Promedio de la calidad de ADN obtenida a partir de los diferentes protocolos en C. alliodora.
Nota:
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05).
Autores (2024).
1.3.
Validez de protocolos
El protocolo de Doyle and Doyle (1990) fue eficaz para extraer ADN en
Cordia
alliodora
, con una cantidad adecuada, aunque con algunos contaminantes proteicos, lo que lo
hace más apropiado para estudios a gran escala, donde se prioriza la simplicidad y el manejo
de grandes volúmenes (Figura
3
).
Figura 3
Extracción de ADN por medio del protocolo de Doyle and Doyle (1990) laboratorio de
Biología Molecular campus La María, UTEQ, 2024.
Nota:
La imagen muestra un gel de agarosa al 1% con ADN extraído de distintas muestras.
Autores (2024).
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1595
El
método
CTAB modificado por
Betancurt
-
Olvera et
al. (2018)
, aunque más eficiente
en la eliminación de contaminantes como polisacáridos y polifenoles, requiere un manejo
meticuloso y tiempos de procesamiento prolongados, lo que limita su aplicabilidad en estudios
con muchas muestras (Figura
4
).
Figura 4
Extracción de ADN por medio del protocolo de CTAB modificado por
Betancurt
-
Olvera et
al.
(2018)
laboratorio de Biología Molecular campus La María, UTEQ, 2024.
Nota:
La imagen muestra un gel de agarosa al 1% con ADN extraído de distintas muestras.
Autores (2024).
El protocolo de Dellaporta et al. (1983) resultó en una cantidad significativa de ADN,
pero con menor pureza debido a la dificultad para eliminar contaminantes secundarios, siendo
más adecuado para estudios preliminares que requieren rapidez (Figura
5
).
Figura 5
Extracción de ADN por medio del protocolo de Dellaporta et al. (1983) laboratorio de
Biología Molecular campus La María, UTEQ, 2024.
Nota:
La imagen muestra un gel de agarosa al 1% con ADN extraído de distintas muestras.
Autores (2024).
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1596
Por otro lado, el PureLink® Plant Total DNA Purification Kit destacó por su pureza y
estandarización, pero su costo elevado lo convierte en una opción limitada para proyectos que
involucran grandes volúmenes de muestras (Figura
6
).
Figura 6
Extracción de ADN por medio del protocolo de PureLink® Plant Total DNA Purification
Kit
laboratorio de Biología Molecular campus La María, UTEQ, 2024.
Nota:
La imagen muestra un gel de agarosa al 1% con ADN extraído de distintas muestras.
Autores (2024).
1.4.
Determinación de costos
El protocolo de Dellaporta et al. (1983) se destacó por ser el más económico
con $
148,96,
lo hace adecuado para estudios preliminares o en laboratorios con presupuestos
limitados. Sin embargo, la menor pureza del ADN limita su uso en aplicaciones avanzadas, ya
que los contaminantes pueden afectar el rendimiento en técnicas como PCR y secuenciac
ión
(Siddique et
al., 2022; Xie et
al., 2023)
.
Si bien el protocolo
CTAB modificado por
Betancurt
-
Olvera et
al. (2018)
tiene un costo más alto
con un valor de $227,71
ofrece un mejor balance
entre costo, rendimiento y calidad, lo cual es crucial para investigaciones que requieren ADN
de alta pureza
(Mavrodiev et
al., 2021)
.
La elección del protocolo debe basarse en los requisitos
específicos del estudio y el presupuesto disponible
(Figura 7).
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Figura 7
Costo por protocolos de extracción en C. alliodora.
Nota:
Autores (2024).
Discusión
Calidad del ADN
El protocolo CTAB modificado no solo mostró superioridad en calidad del ADN, sino
que también se ha demostrado en estudios previos que su aplicabilidad abarca una amplia gama
de especies con composiciones químicas complejas. Investigaciones como las de Abo
ul
-
Maaty
y Oraby (2019)
;
Carey et al. (2023) han destacado que el uso de polivinilpirrolidona (PVP) y
β
-
mercaptoetanol en combinaci
ó
n con CTAB mejora significativamente la pureza del ADN al
neutralizar inhibidores como los polifenoles y polisac
á
ridos, lo c
ual es clave en especies
vegetales complejas
(Aboul
-
Maaty & Oraby, 2019
;
Carey et al., 2023).
A pesar de esta ventaja, es importante considerar que estudios como los de Moghazee
et al. (2024) sugieren que la efectividad del CTAB puede variar entre especies dependiendo de
los niveles específicos de metabolitos secundarios presentes en los tejidos. C
omparado con
métodos como PureLink®, el CTAB demostró ser más eficiente para manejar inhibidores,
$0,00
$50,00
$100,00
$150,00
$200,00
$250,00
$300,00
Doyle and Doyle (1990)
CTAB modificado por Betancurt-Olvera et al.
(2018)
Dellaporta et al. (1983)
PureLink® Plant Total DNA Purification Kit
Costo total por tratamiento
Depreciación de equipos
Costos de materiales y reactivos
Costos de mano de obra
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mientras que PureLink®, a pesar de ofrecer una alta estandarización, mostró limitaciones en la
calidad del ADN obtenido (Moghazee et al., 2024).
Cantidad de ADN
En términos de rendimiento, los resultados obtenidos para
C. alliodora
están en línea
con estudios previos que han resaltado la capacidad del CTAB para extraer altas cantidades de
ADN. Vilanova et al. (2020) introdujeron el protocolo SILEX como una alternativa para
maximizar el rendimiento en especies con características quí
micas similares, aunque con un
enfoque más complejo y menos accesible económicamente
(Vilanova et al., 2020).
Además, investigaciones recientes han enfatizado que el ajuste de variables como la
concentración de NaCl y la duración de la incubación pueden aumentar tanto la pureza como
la cantidad de ADN, lo que confirma la robustez del protocolo CTAB en especies veg
etales
exigentes (Guillardín & MacKay, 2023; Li et al., 2020). Estas optimizaciones permiten que el
CTAB sea particularmente eficaz para aplicaciones avanzadas como la amplificación por PCR
y la secuenciación
(Guillardín & MacKay, 2023).
Validez de los Protocolos
Aunque el protocolo de Doyle y Doyle (1990) es eficaz para estudios preliminares
debido a su simplicidad y bajo costo, presenta limitaciones importantes en pureza, lo que puede
afectar estudios genéticos avanzados. Estas observaciones coinciden con las de
Inglis et al.
(2018), quienes encontraron que la adición de un paso de prelavado con soluciones de sorbitol
puede mejorar significativamente la pureza del ADN obtenido en protocolos económicos
(Inglis et al., 2018).
El protocolo PureLink®, si bien adecuado para estudios especializados, muestra un
menor rendimiento en aplicaciones que requieren grandes volúmenes de ADN, lo que limita su
aplicabilidad en estudios a gran escala.
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Análisis Económico
El protocolo CTAB modificado destaca no solo por su efectividad, sino también por su
viabilidad económica en comparación con métodos comerciales como PureLink®. Fu et al.
(2017) y
Mavrodiev et al. (2021) han resaltado que ajustes como la regeneración de columnas
y el uso de reactivos más accesibles pueden reducir significativamente los costos sin
comprometer la calidad del ADN obtenido
(Fu et al., 2017
;
Mavrodiev et al., 2021).
Por otro lado, el costo elevado de PureLink® puede ser justificable únicamente en
proyectos con presupuestos amplios, como lo sugieren Arseneau et al. (2017), quienes también
destacan que la efectividad de los métodos basados en CTAB ajustados puede ser ig
ual o
superior a la de los kits comerciales, con costos significativamente menores (Arseneau et al.,
2017).
La comparación con estudios previos consolida al protocolo CTAB modificado como
una solución robusta, económica y adaptable para la extracción de ADN en especies vegetales
complejas. Sus ventajas en calidad, cantidad y costo lo posicionan como la opción pr
eferida
para estudios moleculares avanzados, superando las limitaciones de métodos comerciales en
términos de aplicabilidad y accesibilidad.
Conc
l
usión
El protocolo
CTAB modificado por
Betancurt
-
Olvera et
al. (2018)
proporcionó el
mayor rendimiento de ADN en
Cordia alliodora
, alcanzando hasta 46,25 ng/µl, gracias a su
capacidad para manejar la complejidad del tejido vegetal. Aunque no hubo diferencias
significativas entre los protocolos evaluados, CTAB destacó por su equilibrio entre cantidad y
calidad de ADN, garantizando al
ta pureza esencial para estudios genómicos. El uso de una
mínima cantidad de RNasa preservó la integridad del ADN, mientras que métodos con mayores
dosis mostraron una ligera degradación.
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1600
El protocolo de Dellaporta fue el más económico, siendo adecuado para laboratorios
con presupuestos limitados o que necesitan procesar grandes volúmenes. Aunque más costoso,
CTAB modificado por
Betancurt
-
Olvera et
al. (2018)
sigue siendo ideal para la obtención de
ADN altamente puro en estudios avanzados.
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Betancurt
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